自從17世紀自學成才的安東尼•范•列文虎克透過手工制作的鏡片發現了一群“微小動物”以來，科學家們一直在努力進行更近距離的觀察。隨著分子生物學的出現，生物學家對細胞的研究主要集中在逐漸變小的結構的多樣性上，近年來也專注于研究逐漸縮小的樣本。
縮小樣本量對于理解多細胞生物學的一個核心悖論是很重要的：每個細胞都是一個個體，但必須與周圍的細胞協調活動。因此，生物學家真正想要的是一種可以單獨研究每個細胞中單個分子的方法，然后將結果關聯起來。
這是一項艱巨的任務，但是生物化學、微流體學、生物信息學和細胞培養的最新進展已經在填補這一空白方面取得了長足的進步。如今，研究人員可以對基因組DNA或信使RNA進行測序、對蛋白質進行編目，或者對單個細胞的染色質結構進行表征，并在實驗中數百次甚至數千次地重復這一過程，生成非常詳細的個體和集體細胞活動圖像。隨著這些單細胞技術的不斷發展，科學家們正在采取下一個合乎邏輯的步驟，即結合分析，一次性研究每個細胞中兩個或更多參數。
分離不等于均等
最初，研究人員試圖從單獨的細胞中合成單細胞數據。例如，通過對一個樣本進行單細胞信使RNA測序，并對備份樣本進行染色質可及性分析。他們假設每個樣本中都有完全相等的細胞，然后通過計算將這些模式聯系起來。“然而，即使這些細胞來自同一個原始樣本，試圖將細胞之間的不同模式聯系起來也存在計算上的挑戰。”位于加利福尼亞州普萊森頓的10X Genomics公司創始科學家Michael Schnall-Levin表示。
最近，細胞生物學家和技術公司開發了新一代方法，被稱為單細胞多組學、下一代多組學或多模態組學，其旨在單個樣本上進行單細胞水平的復合分析。單細胞多組學不是通過計算合成相關性，而是以多種方式直接觀察每個細胞。“一些最早的方法可以同時檢測來自同一細胞的RNA和蛋白質，如CITE-seq技術和REAP-seq技術；或檢測來自同一細胞的RNA和CRISPR引導RNA，如Perturb-seq技術。”Schnall-Levin說。雖然最初的概念驗證實驗集中在免疫細胞上，但現在單細胞多組學也在癌癥研究中獲得了關注。
不管他們想要跟蹤的參數是什么，不熟悉單細胞分析的研究人員應該花一些時間考慮樣品制備。“在測量具有不同穩定性的分析物時，這一點尤為重要……我想說，樣品準備和實驗方法是一種平衡，以確保不同分析物能同時以最好的方式被檢測到。”Schnall-Levin表示。
一旦實驗室部分完成，單細胞多組學就呈現出獨特的生物信息學挑戰。每增加一個分析物就意味著又多了一層需要處理的數據，也增加了研究人員需要處理的信息總量。不過，多組學方法也有一些補償性優勢。“聯合測量‘—組學’消除了為推斷不同單細胞數據集之間關系而采用計算策略的需求。”Schnall-Levin解釋道。
作為單細胞測序技術的主要供應商，10X Genomics公司已經調整了其產品線以迎合迅速發展的多組學趨勢，該公司現在銷售用于分析幾種不同靶標組合的設備和試劑。Schnall-Levin預計，這些產品將隨著該領域的發展而不斷增多。特別是，他預計研究人員會將更多類型的分析結合到單個實驗中。事實上，一些免疫學家已經在單細胞水平上一次測量多達5個參數，并且這個數字似乎還在增長。
讓液滴“排排隊”
隨著研究人員在單細胞實驗中增加更多的分析維度，他們遇到了一些棘手問題。“人們研究多組學的典型途徑是在RNA上添加其他簡單分子，如蛋白質或表觀遺傳標記……這在全基因組和全轉錄組水平上很容易得到。”位于加利福尼亞州南舊金山的Mission Bio公司軟件和信息學副總裁Anup Parikh表示。
雖然將單個細胞中的轉錄組和表達蛋白質組相關聯提供了有用的交叉檢查，但研究人員越來越想進行包括完全正交特性的測量，如細胞的染色體拷貝數或基因組序列。由于DNA測序需要破壞細胞，因此它與需要完整細胞且同步進行的轉錄組或蛋白質組分析并不兼容。
為了解決這個問題，Mission Bio公司提供了一種微流體系統，其可以對單個細胞進行一系列分析，同時跟蹤每個細胞在其中的過程。該系統從懸浮液中分離出單個細胞，將每個細胞分離成帶有分子條形碼的液滴。然后，這些帶條形碼的液滴會像傳送帶上的包裹一樣，通過Mission Bio公司設備上的微流體通道，“拜訪”進行不同分析的反應室。
“我們不會在這個過程中失去任何東西，但是可以用一些蛋白酶處理來打破細胞的反應，與用聚合酶來擴增DNA或分析蛋白質以及細胞外的其他任何東西的反應分開。”Parikh說道。通過將非破壞性步驟置于破壞性步驟之前，該系統可以從每個細胞中獲得蛋白質組學、轉錄組學、基因組學和表觀基因組學數據。
擁有如此多的選擇，研究人員必須小心不能貪多嚼不爛。“當處理這些類型的項目時，它很快就會變得復雜，所以你要確保有一個真正有根據的科學問題，因為其可以產生巨大的數據集。”Mission Bio公司轉化應用和市場開發主管Aaron Llanso指出。
這種關注也影響了該公司的數據處理方法。“我們采取了一種非常有條理的方法來構建有助于我們的科學家和制藥公司的應用程序的信息學解決方案。這不是一種獵槍式的方法，我們有通用工具，更多的是‘我能幫助回答一個關于特定癌癥類型中癌癥克隆進化的問題嗎’?”Parikh說。
越過彩虹
鑒于微流體可對細胞和試劑進行精細控制，其他公司為特定類型的單細胞分析提供微流體解決方案不足為奇。對位于密蘇里州圣路易斯市的Canopy生物科學公司來說，這意味著要更新古老的免疫熒光顯微鏡技術。傳統上，研究人員用不同顏色的熒光染料標記抗體，一次可視化幾種不同細胞蛋白的表達，但這種方法只適用少數幾個表位。細胞表達的蛋白質要比熒光染料標記的顏色多得多。
Canopy公司的微流體系統會進行自動化熒光標記和圖像處理，然后重復它們。“我們以迭代的方式進行染色，以建立真正的高復合分析，所以你可以（在微流控芯片上）用多達5種抗體的混合物進行染色，收集這5種抗體的圖像數據，接著擦掉熒光信號，然后再次染色。”Canopy公司產品經理Thomas Campbell說。系統將圖像數據堆疊起來，繪制出樣本中每個細胞所有蛋白質的表達圖譜。雖然芯片的容量沒有任何限制，但到目前為止，通常它每次可實驗分析20至50個蛋白質。
芯片還能保存細胞。“你可以把樣本存放在冰箱里長達兩年，然后把它拿出來并從你停下來的地方繼續，在之前分析的基礎上重新審視樣本。”Campbell表示。對于研究寶貴臨床樣本的研究人員來說，這可能是一個特別有用的功能。這也意味著，隨著技術的不斷發展，用戶能夠將新技術應用于以前的樣本。
原則上，Canopy系統可以用在任何傳統上依賴免疫熒光的領域。“該平臺的優點之一是它在樣本類型方面非常靈活，我們可以做組織切片，包括新鮮的、冷凍的以及用福爾馬林固定石蠟包埋的，還可以做各種不同的細胞懸浮液。”Campbell說，目前大多數客戶都在免疫學或腫瘤學領域工作，但該公司還支持新冠病毒免疫分析研究和神經科學應用。
排序困境
微流體并不是實現單細胞多組學的唯一途徑。事實上，對免疫學家而言，分離并分析單個細胞并不是一種新觀念。多年來，他們一直在使用流式細胞儀以多種方式分離并研究熒光標記細胞。位于新澤西州富蘭克林湖的BD生物科學公司是流式細胞儀設備的主要制造商之一，該公司現在也銷售一整套為單細胞多組學量身定制的附加組件。
事實上，BD公司現在銷售幾乎涵蓋了單細胞多組學實驗的整個流程——從采血管、細胞分離緩沖液到流式細胞儀——的一系列設備、耗材和試劑。
“一旦（流式細胞術富集）完成，我們就會進入BD Rhapsody系統，這是一個非常獨特的單細胞分割系統。”BD公司高級營銷總監Ranga Partha說。Rhapsody微孔設計旨在保護脆弱的細胞，如粒細胞、中性粒細胞和干細胞，而且該系統還包括一個用于視覺質量控制的掃描設備。用于蛋白質和RNA分析的輔助設備和試劑，無論是靶向還是跟蹤整個轉錄組，都會使系統更加完善。該公司還在開發一種可變的、多樣化和可連接[V（D）J]測序的系統，該系統將表征單細胞中的抗體基因重排。
雖然目前Rhapsody檢測顯然是針對免疫學家的，但該領域與癌癥研究的重疊并未逃過該公司的注意。“我相信這項技術未來將專注于腫瘤領域生物標志物的發現。”Partha指出。
然而，即使對具有豐富流式細胞儀技術經驗的科學家而言，單細胞多組學也面臨著獨特的挑戰。Partha指出，樣品制備、細胞活力檢測和生物信息學是該領域新人面臨的三大障礙。“讓技術嫻熟、訓練有素的研究人員完成這三項工作是一項挑戰。”
為了解決這個問題，他敦促研究人員與做過類似實驗的同事交談，并與出售試劑和設備的公司聯系。“我認為與提供檢測的公司的技術應用專家進行對話是一個很好的步驟……但研究人員有時會忽略它，他們繼續進行實驗，最后數據的復雜性會變得非常高。”Partha說，與該領域的其他專家一樣，生物信息學是一個不斷發展的挑戰，隨著研究人員在單細胞實驗中增加更多實驗，這個挑戰可能會變得更加重要。
尋求專業幫助
盡管困難重重，但單細胞多組學的普及速度幾乎與實驗的復雜性上升速度一樣快。“這絕對是一個熱門的新興領域。”位于新澤西州南普萊恩菲爾德的Genewiz公司臨床開發服務主管Haythem Latif表示。不過，并不是每個對該領域感興趣的人都有能力進行深入研究。幸運的是，像Genewiz這樣的研究公司很樂意幫助那些愿意把部分或全部實驗工作外包出去的研究人員。
當選擇一家服務公司時，科學家期望花一些時間討論他們的研究、想要解決的具體問題以及公司可以提供的技術。“我們合作得很好……確保這些類型的技術參數與手頭的生物學問題相匹配。”Latif說。這些早期的談話可以避免以后的麻煩。“如果你在生物學上做的事情存在一些可行性問題，這些問題可能會被提出或者以不同的方式處理。”Latif表示。
服務提供商應該始終為每個項目定制方法，但在許多情況下，他們會集中在老生常談的路徑上。例如，最近一種流行的策略是在單細胞水平上應用10X Genomics公司的轉錄組學分析技術和表面蛋白標記來獲取相應的蛋白質組學信息。“這是一個非常簡潔的工作流程，它是與許多客戶一起開發的……為了把這兩條信息結合起來。”Latif說。他補充道，研究人員還開始增加空間分析，以便定位細胞表面的蛋白質。
到目前為止，腫瘤學家和免疫學家是單細胞多組學最大的應用者。Genewiz公司代表指出，其他領域也在研究這項技術。“干細胞分化和多能性領域對單細胞多組學有很大興趣……有助于描述干細胞及其分化過程，其在神經科學領域也得到了應用。”該公司首席科學家Dave Corney說。
不管他們追求的具體策略是什么，專家們一致認為，單細胞多組學才剛剛起步，未來發展潛力巨大。“人體有40萬億個細胞，這些細胞一直在變化。為研究人員提供工具來研究這些發現，將使我們更了解癌癥、阿爾茨海默病或心臟病的病因——這就是我們想要做的。”Schnall-Levin說。■
Alan Dove 是馬薩諸塞州的科學作者和編輯。
鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發布在2021年9月24日《科學》雜志”。官方英文版請見https://www.science.org/content/article/combine-and-conquer-single-cell-omics-multiplies。