自從17世紀(jì)自學(xué)成才的安東尼•范•列文虎克透過手工制作的鏡片發(fā)現(xiàn)了一群“微小動(dòng)物”以來，科學(xué)家們一直在努力進(jìn)行更近距離的觀察。隨著分子生物學(xué)的出現(xiàn)，生物學(xué)家對(duì)細(xì)胞的研究主要集中在逐漸變小的結(jié)構(gòu)的多樣性上，近年來也專注于研究逐漸縮小的樣本。
縮小樣本量對(duì)于理解多細(xì)胞生物學(xué)的一個(gè)核心悖論是很重要的：每個(gè)細(xì)胞都是一個(gè)個(gè)體，但必須與周圍的細(xì)胞協(xié)調(diào)活動(dòng)。因此，生物學(xué)家真正想要的是一種可以單獨(dú)研究每個(gè)細(xì)胞中單個(gè)分子的方法，然后將結(jié)果關(guān)聯(lián)起來。
這是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，但是生物化學(xué)、微流體學(xué)、生物信息學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)的最新進(jìn)展已經(jīng)在填補(bǔ)這一空白方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。如今，研究人員可以對(duì)基因組DNA或信使RNA進(jìn)行測(cè)序、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行編目，或者對(duì)單個(gè)細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并在實(shí)驗(yàn)中數(shù)百次甚至數(shù)千次地重復(fù)這一過程，生成非常詳細(xì)的個(gè)體和集體細(xì)胞活動(dòng)圖像。隨著這些單細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，科學(xué)家們正在采取下一個(gè)合乎邏輯的步驟，即結(jié)合分析，一次性研究每個(gè)細(xì)胞中兩個(gè)或更多參數(shù)。
分離不等于均等
最初，研究人員試圖從單獨(dú)的細(xì)胞中合成單細(xì)胞數(shù)據(jù)。例如，通過對(duì)一個(gè)樣本進(jìn)行單細(xì)胞信使RNA測(cè)序，并對(duì)備份樣本進(jìn)行染色質(zhì)可及性分析。他們假設(shè)每個(gè)樣本中都有完全相等的細(xì)胞，然后通過計(jì)算將這些模式聯(lián)系起來。“然而，即使這些細(xì)胞來自同一個(gè)原始樣本，試圖將細(xì)胞之間的不同模式聯(lián)系起來也存在計(jì)算上的挑戰(zhàn)。”位于加利福尼亞州普萊森頓的10X Genomics公司創(chuàng)始科學(xué)家Michael Schnall-Levin表示。
最近，細(xì)胞生物學(xué)家和技術(shù)公司開發(fā)了新一代方法，被稱為單細(xì)胞多組學(xué)、下一代多組學(xué)或多模態(tài)組學(xué)，其旨在單個(gè)樣本上進(jìn)行單細(xì)胞水平的復(fù)合分析。單細(xì)胞多組學(xué)不是通過計(jì)算合成相關(guān)性，而是以多種方式直接觀察每個(gè)細(xì)胞。“一些最早的方法可以同時(shí)檢測(cè)來自同一細(xì)胞的RNA和蛋白質(zhì)，如CITE-seq技術(shù)和REAP-seq技術(shù)；或檢測(cè)來自同一細(xì)胞的RNA和CRISPR引導(dǎo)RNA，如Perturb-seq技術(shù)。”Schnall-Levin說。雖然最初的概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)集中在免疫細(xì)胞上，但現(xiàn)在單細(xì)胞多組學(xué)也在癌癥研究中獲得了關(guān)注。
不管他們想要跟蹤的參數(shù)是什么，不熟悉單細(xì)胞分析的研究人員應(yīng)該花一些時(shí)間考慮樣品制備。“在測(cè)量具有不同穩(wěn)定性的分析物時(shí)，這一點(diǎn)尤為重要……我想說，樣品準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)方法是一種平衡，以確保不同分析物能同時(shí)以最好的方式被檢測(cè)到。”Schnall-Levin表示。
一旦實(shí)驗(yàn)室部分完成，單細(xì)胞多組學(xué)就呈現(xiàn)出獨(dú)特的生物信息學(xué)挑戰(zhàn)。每增加一個(gè)分析物就意味著又多了一層需要處理的數(shù)據(jù)，也增加了研究人員需要處理的信息總量。不過，多組學(xué)方法也有一些補(bǔ)償性優(yōu)勢(shì)。“聯(lián)合測(cè)量‘—組學(xué)’消除了為推斷不同單細(xì)胞數(shù)據(jù)集之間關(guān)系而采用計(jì)算策略的需求。”Schnall-Levin解釋道。
作為單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的主要供應(yīng)商，10X Genomics公司已經(jīng)調(diào)整了其產(chǎn)品線以迎合迅速發(fā)展的多組學(xué)趨勢(shì)，該公司現(xiàn)在銷售用于分析幾種不同靶標(biāo)組合的設(shè)備和試劑。Schnall-Levin預(yù)計(jì)，這些產(chǎn)品將隨著該領(lǐng)域的發(fā)展而不斷增多。特別是，他預(yù)計(jì)研究人員會(huì)將更多類型的分析結(jié)合到單個(gè)實(shí)驗(yàn)中。事實(shí)上，一些免疫學(xué)家已經(jīng)在單細(xì)胞水平上一次測(cè)量多達(dá)5個(gè)參數(shù)，并且這個(gè)數(shù)字似乎還在增長(zhǎng)。
讓液滴“排排隊(duì)”
隨著研究人員在單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中增加更多的分析維度，他們遇到了一些棘手問題。“人們研究多組學(xué)的典型途徑是在RNA上添加其他簡(jiǎn)單分子，如蛋白質(zhì)或表觀遺傳標(biāo)記……這在全基因組和全轉(zhuǎn)錄組水平上很容易得到。”位于加利福尼亞州南舊金山的Mission Bio公司軟件和信息學(xué)副總裁Anup Parikh表示。
雖然將單個(gè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)蛋白質(zhì)組相關(guān)聯(lián)提供了有用的交叉檢查，但研究人員越來越想進(jìn)行包括完全正交特性的測(cè)量，如細(xì)胞的染色體拷貝數(shù)或基因組序列。由于DNA測(cè)序需要破壞細(xì)胞，因此它與需要完整細(xì)胞且同步進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組分析并不兼容。
為了解決這個(gè)問題，Mission Bio公司提供了一種微流體系統(tǒng)，其可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行一系列分析，同時(shí)跟蹤每個(gè)細(xì)胞在其中的過程。該系統(tǒng)從懸浮液中分離出單個(gè)細(xì)胞，將每個(gè)細(xì)胞分離成帶有分子條形碼的液滴。然后，這些帶條形碼的液滴會(huì)像傳送帶上的包裹一樣，通過Mission Bio公司設(shè)備上的微流體通道，“拜訪”進(jìn)行不同分析的反應(yīng)室。
“我們不會(huì)在這個(gè)過程中失去任何東西，但是可以用一些蛋白酶處理來打破細(xì)胞的反應(yīng)，與用聚合酶來擴(kuò)增DNA或分析蛋白質(zhì)以及細(xì)胞外的其他任何東西的反應(yīng)分開。”Parikh說道。通過將非破壞性步驟置于破壞性步驟之前，該系統(tǒng)可以從每個(gè)細(xì)胞中獲得蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)和表觀基因組學(xué)數(shù)據(jù)。
擁有如此多的選擇，研究人員必須小心不能貪多嚼不爛。“當(dāng)處理這些類型的項(xiàng)目時(shí)，它很快就會(huì)變得復(fù)雜，所以你要確保有一個(gè)真正有根據(jù)的科學(xué)問題，因?yàn)槠淇梢援a(chǎn)生巨大的數(shù)據(jù)集。”Mission Bio公司轉(zhuǎn)化應(yīng)用和市場(chǎng)開發(fā)主管Aaron Llanso指出。
這種關(guān)注也影響了該公司的數(shù)據(jù)處理方法。“我們采取了一種非常有條理的方法來構(gòu)建有助于我們的科學(xué)家和制藥公司的應(yīng)用程序的信息學(xué)解決方案。這不是一種獵槍式的方法，我們有通用工具，更多的是‘我能幫助回答一個(gè)關(guān)于特定癌癥類型中癌癥克隆進(jìn)化的問題嗎’?”Parikh說。
越過彩虹
鑒于微流體可對(duì)細(xì)胞和試劑進(jìn)行精細(xì)控制，其他公司為特定類型的單細(xì)胞分析提供微流體解決方案不足為奇。對(duì)位于密蘇里州圣路易斯市的Canopy生物科學(xué)公司來說，這意味著要更新古老的免疫熒光顯微鏡技術(shù)。傳統(tǒng)上，研究人員用不同顏色的熒光染料標(biāo)記抗體，一次可視化幾種不同細(xì)胞蛋白的表達(dá)，但這種方法只適用少數(shù)幾個(gè)表位。細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)要比熒光染料標(biāo)記的顏色多得多。
Canopy公司的微流體系統(tǒng)會(huì)進(jìn)行自動(dòng)化熒光標(biāo)記和圖像處理，然后重復(fù)它們。“我們以迭代的方式進(jìn)行染色，以建立真正的高復(fù)合分析，所以你可以（在微流控芯片上）用多達(dá)5種抗體的混合物進(jìn)行染色，收集這5種抗體的圖像數(shù)據(jù)，接著擦掉熒光信號(hào)，然后再次染色。”Canopy公司產(chǎn)品經(jīng)理Thomas Campbell說。系統(tǒng)將圖像數(shù)據(jù)堆疊起來，繪制出樣本中每個(gè)細(xì)胞所有蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜。雖然芯片的容量沒有任何限制，但到目前為止，通常它每次可實(shí)驗(yàn)分析20至50個(gè)蛋白質(zhì)。
芯片還能保存細(xì)胞。“你可以把樣本存放在冰箱里長(zhǎng)達(dá)兩年，然后把它拿出來并從你停下來的地方繼續(xù)，在之前分析的基礎(chǔ)上重新審視樣本。”Campbell表示。對(duì)于研究寶貴臨床樣本的研究人員來說，這可能是一個(gè)特別有用的功能。這也意味著，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，用戶能夠?qū)⑿录夹g(shù)應(yīng)用于以前的樣本。
原則上，Canopy系統(tǒng)可以用在任何傳統(tǒng)上依賴免疫熒光的領(lǐng)域。“該平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)之一是它在樣本類型方面非常靈活，我們可以做組織切片，包括新鮮的、冷凍的以及用福爾馬林固定石蠟包埋的，還可以做各種不同的細(xì)胞懸浮液。”Campbell說，目前大多數(shù)客戶都在免疫學(xué)或腫瘤學(xué)領(lǐng)域工作，但該公司還支持新冠病毒免疫分析研究和神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用。
排序困境
微流體并不是實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞多組學(xué)的唯一途徑。事實(shí)上，對(duì)免疫學(xué)家而言，分離并分析單個(gè)細(xì)胞并不是一種新觀念。多年來，他們一直在使用流式細(xì)胞儀以多種方式分離并研究熒光標(biāo)記細(xì)胞。位于新澤西州富蘭克林湖的BD生物科學(xué)公司是流式細(xì)胞儀設(shè)備的主要制造商之一，該公司現(xiàn)在也銷售一整套為單細(xì)胞多組學(xué)量身定制的附加組件。
事實(shí)上，BD公司現(xiàn)在銷售幾乎涵蓋了單細(xì)胞多組學(xué)實(shí)驗(yàn)的整個(gè)流程——從采血管、細(xì)胞分離緩沖液到流式細(xì)胞儀——的一系列設(shè)備、耗材和試劑。
“一旦（流式細(xì)胞術(shù)富集）完成，我們就會(huì)進(jìn)入BD Rhapsody系統(tǒng)，這是一個(gè)非常獨(dú)特的單細(xì)胞分割系統(tǒng)。”BD公司高級(jí)營(yíng)銷總監(jiān)Ranga Partha說。Rhapsody微孔設(shè)計(jì)旨在保護(hù)脆弱的細(xì)胞，如粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和干細(xì)胞，而且該系統(tǒng)還包括一個(gè)用于視覺質(zhì)量控制的掃描設(shè)備。用于蛋白質(zhì)和RNA分析的輔助設(shè)備和試劑，無論是靶向還是跟蹤整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，都會(huì)使系統(tǒng)更加完善。該公司還在開發(fā)一種可變的、多樣化和可連接[V（D）J]測(cè)序的系統(tǒng)，該系統(tǒng)將表征單細(xì)胞中的抗體基因重排。
雖然目前Rhapsody檢測(cè)顯然是針對(duì)免疫學(xué)家的，但該領(lǐng)域與癌癥研究的重疊并未逃過該公司的注意。“我相信這項(xiàng)技術(shù)未來將專注于腫瘤領(lǐng)域生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。”Partha指出。
然而，即使對(duì)具有豐富流式細(xì)胞儀技術(shù)經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)家而言，單細(xì)胞多組學(xué)也面臨著獨(dú)特的挑戰(zhàn)。Partha指出，樣品制備、細(xì)胞活力檢測(cè)和生物信息學(xué)是該領(lǐng)域新人面臨的三大障礙。“讓技術(shù)嫻熟、訓(xùn)練有素的研究人員完成這三項(xiàng)工作是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。”
為了解決這個(gè)問題，他敦促研究人員與做過類似實(shí)驗(yàn)的同事交談，并與出售試劑和設(shè)備的公司聯(lián)系。“我認(rèn)為與提供檢測(cè)的公司的技術(shù)應(yīng)用專家進(jìn)行對(duì)話是一個(gè)很好的步驟……但研究人員有時(shí)會(huì)忽略它，他們繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后數(shù)據(jù)的復(fù)雜性會(huì)變得非常高。”Partha說，與該領(lǐng)域的其他專家一樣，生物信息學(xué)是一個(gè)不斷發(fā)展的挑戰(zhàn)，隨著研究人員在單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中增加更多實(shí)驗(yàn)，這個(gè)挑戰(zhàn)可能會(huì)變得更加重要。
尋求專業(yè)幫助
盡管困難重重，但單細(xì)胞多組學(xué)的普及速度幾乎與實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性上升速度一樣快。“這絕對(duì)是一個(gè)熱門的新興領(lǐng)域。”位于新澤西州南普萊恩菲爾德的Genewiz公司臨床開發(fā)服務(wù)主管Haythem Latif表示。不過，并不是每個(gè)對(duì)該領(lǐng)域感興趣的人都有能力進(jìn)行深入研究。幸運(yùn)的是，像Genewiz這樣的研究公司很樂意幫助那些愿意把部分或全部實(shí)驗(yàn)工作外包出去的研究人員。
當(dāng)選擇一家服務(wù)公司時(shí)，科學(xué)家期望花一些時(shí)間討論他們的研究、想要解決的具體問題以及公司可以提供的技術(shù)。“我們合作得很好……確保這些類型的技術(shù)參數(shù)與手頭的生物學(xué)問題相匹配。”Latif說。這些早期的談話可以避免以后的麻煩。“如果你在生物學(xué)上做的事情存在一些可行性問題，這些問題可能會(huì)被提出或者以不同的方式處理。”Latif表示。
服務(wù)提供商應(yīng)該始終為每個(gè)項(xiàng)目定制方法，但在許多情況下，他們會(huì)集中在老生常談的路徑上。例如，最近一種流行的策略是在單細(xì)胞水平上應(yīng)用10X Genomics公司的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)和表面蛋白標(biāo)記來獲取相應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)信息。“這是一個(gè)非常簡(jiǎn)潔的工作流程，它是與許多客戶一起開發(fā)的……為了把這兩條信息結(jié)合起來。”Latif說。他補(bǔ)充道，研究人員還開始增加空間分析，以便定位細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)。
到目前為止，腫瘤學(xué)家和免疫學(xué)家是單細(xì)胞多組學(xué)最大的應(yīng)用者。Genewiz公司代表指出，其他領(lǐng)域也在研究這項(xiàng)技術(shù)。“干細(xì)胞分化和多能性領(lǐng)域?qū)渭?xì)胞多組學(xué)有很大興趣……有助于描述干細(xì)胞及其分化過程，其在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域也得到了應(yīng)用。”該公司首席科學(xué)家Dave Corney說。
不管他們追求的具體策略是什么，專家們一致認(rèn)為，單細(xì)胞多組學(xué)才剛剛起步，未來發(fā)展?jié)摿薮蟆?ldquo;人體有40萬億個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞一直在變化。為研究人員提供工具來研究這些發(fā)現(xiàn)，將使我們更了解癌癥、阿爾茨海默病或心臟病的病因——這就是我們想要做的。”Schnall-Levin說。■
Alan Dove 是馬薩諸塞州的科學(xué)作者和編輯。
鳴謝：“原文由美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)（www.aaas.org）發(fā)布在2021年9月24日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請(qǐng)見https://www.science.org/content/article/combine-and-conquer-single-cell-omics-multiplies。