Bridget Carragher表示，幾十年來，冷凍電鏡技術（cryo-EM）一直是一個“小眾且狹小”的領域。但在2017年，冷凍電鏡技術通過了蛋白質數據庫（Protein Data Bank）——世界上唯一的蛋白質、核酸和大型生物分子3D結構的數據資源庫——中多項年度條目的核磁共振波譜（NMR）�，F在，它正在超越結構方法的鼻祖——X射線晶體學。
Carragher在紐約結構生物學中心領導一個由美國國立衛生研究院（NIH）和西蒙斯基金會支持的冷凍電鏡設施。另外兩個NIH資助的中心在斯坦福大學和俄勒岡健康與科學大學（OHSU）。奧爾胡斯大學結構生物學家Poul Nissen表示：“各地的趨勢是使用國家冷凍電鏡設施。”
隨著軟件和硬件的突破，特別是在電子探測器方面的突破，國家中心服務的冷凍電鏡技術團體正在迅速擴大，展示了冷凍電鏡技術是如何推進基礎研究、藥物開發甚至太陽能電池技術的。
晶體分辨率——沒有晶體，但要付出代價
與X射線晶體學不同，冷凍電鏡技術不需要結晶樣品，這省去了一個耗時的步驟，并允許在原子級重建塊狀復合體和完整的膜蛋白，阻止結晶。它可以顯示構象的變化，例如核糖體在蛋白質合成過程中會彎曲其結構。
冷凍電鏡技術適用于未染色的水性樣品。對于單粒子分析（SPA），這是其最常見的應用。研究人員將樣品放到一個網格上，該網格通過注入液態乙烷急速冷卻。這種冷凍——或者更確切地說是玻璃化——是如此之快，以至于樣品分子被固定，其結構得以保持不變，而且沒有干擾透射電子顯微鏡（TEM）的冰晶。然后，研究人員通過將電子束穿過樣品來拍攝數千張TEM圖像。以隨機方向捕獲的分子會散射電子，從而創建用于生成3D模型的模式。
NIH冷凍電鏡技術中心副主任Craig Yoshioka指出了一個很有前途的發展：通過截短或突變蛋白質來誘變成晶體的晶體學家，現在可以使用冷凍電鏡技術研究完整的野生型蛋白質。“這應該能更好地代表其天然狀態的靶標，包括像糖基化這樣的翻譯后修飾。”
目前，SPA最適用于200kDa左右的大樣本，所以研究較小蛋白質的研究人員可能會轉向微晶電子衍射（microED），這是一種具有更大尺寸范圍的冷凍電鏡技術。SPA的另一個問題是它使用細胞提取物，但在細胞內部，“蛋白質不是漂浮在水中的。它們與其他成分相互作用或形成網絡，在提取過程中破裂”，加州大學圣地亞哥分校生物物理學家Elizabeth Villa表示。Villa使用冷凍電子斷層掃描技術（cryo-ET）對細胞甚至組織切片進行成像，從而在原位可視化組件。
而且冷凍電鏡技術有一個最大的缺點：成本。頂級的300千電子伏特（keV）冷凍電鏡機器價值約為500萬至700萬美元。
制藥公司可能有內部設施或使用像NanoImaging Services這樣的公司提供的設備。該公司聯合創始人Carragher指出，大多數冷凍電鏡客戶來自制藥或生物技術公司，示例項目包括分析疫苗、抗體和藥物靶標。在冷凍電鏡承包商中，該公司是少有的擁有自己設備的公司，而其他公司通常使用合作機構的設備。
主要的研究機構也投資于冷凍電鏡設備，但規模較小的大學負擔不起。然而，包括Gabriel Lander團隊在內的斯克里普斯研究所的科學家們使用功率較低的100keV或200keV顯微鏡揭示了蛋白質的單埃（Å）結構，花費了100萬~200萬美元。這些結果鼓勵了那些呼吁使用更實惠、更耐用的儀器使冷凍電鏡技術大眾化的科學家。
共同體服務
由于新的NIH中心擁有尖端設備并專注于服務和培訓，冷凍電鏡技術的使用應該會增加，而且培訓中心的人員不得成為用戶出版物的合著者。據Yoshioka估計，在滿負荷運轉的情況下，俄勒岡健康與科學大學站點將在同一時間收集200~300個活躍項目的24/7全天候數據，每年培訓50多名來訪科學家。他預計每個中心每年將會進行數百次重建。
而且服務是免費的。“你寫了一份提案。”Carragher說，“如果它基于科學價值、可行性和需求等標準被接受，你就會得到冷凍電鏡技術的使用時間。”這個模型類似于國家同步加速器設施，而且還有許多這樣的設施，例如英國鉆石光源的電子生物成像中心和巴西能源和材料研究中心的巴西納米技術國家實驗室（LNNano），都位于同步加速器附近。
LNNano研究員Rodrigo Portugal表示，工業客戶需要支付服務費用，但在項目評估后，對學術研究人員的服務和培訓是免費的。
LNNano高級科學家Marin van Heel指出，冷凍電鏡技術是基于結構的藥物和疫苗設計的強大工具，由于“像寨卡等被忽視的疾病的需求巨大”，因此它在該地區至關重要。LNNano正在與巴西、秘魯、烏拉圭和阿根廷的合作伙伴進行SPA研究。
除了成本，LNNano設施的主要負擔是人才流失。盡管舉辦了多場研討會和一年一度的巴西單粒子冷凍電鏡學院，但“人們還是會被另一個國家的中心或制藥公司挖走”，van Heel直言。
“這是問題所在”
冷凍電鏡技術的軟件和硬件已經得到了“突飛猛進”的發展。Yoshika說：“但要可靠地將任何蛋白質從基因中提取到結構中仍然很困難。”冷凍電鏡技術不需要大晶體，但樣品純度、異質性和濃度仍然很重要。
“樣品準備不是問題。”Carragher說。在玻璃化過程中，“顆粒自身會粘合在一起，粘附在空氣—水界面上，形成不穩定的構象或者解體。”商用自動化系統使樣品制備更加可靠。然而，下游的挑戰是由需要專用工作站的tb級數據引起的。
數字化的發展
冷凍電鏡技術的用戶們一致稱贊軟件小組在數據分析和結構解析方面的進步。Yoshioka表示，開源軟件如來自英國醫學研究委員會分子生物學實驗室Sjors Scheres的RELION，以及包括Janelia研究園區和馬薩諸塞大學的Niko grigoriieff在內的其他人的工作對該領域發揮了重要作用。他指出，計算技術的一個新興的進步是數據收集時的實時處理和重構。
這正是cryoSPARC Live所做的。該軟件由多倫多大學的子公司Structura Biotechnology開發，目前正在進行beta測試，該公司由Ali Punjani和Saara Virani兄妹團隊運營。CryoSPARC Live增加了SPA工具的CryoSPARC包，包括2D圖像管理和3D重建，而無需事先了解結構知識。
Virani指出，CryoSPARC Live會在幾分鐘后顯示初始圖像，在大約一小時內顯示6-Å到8-Å的3D結構，并在幾小時后顯示精細的高分辨率結構。她說，研究人員可以進行實時調整，比如移動樣本以專注于最佳領域，并決定要收集多少數據，從而節省時間和金錢。隨著冷凍電鏡技術需求的迅速增長，該領域正在努力解決商業化問題。Punjani解釋道，cryoSPARC對學術用戶是免費的，而制藥公司等商業客戶必須購買許可證。
Punjani指出，從冷凍電鏡技術大眾化的計算角度來看，是為了改進算法，以從低端顯微鏡獲得更好的圖像。此外，云托管的計算可以讓實驗室根據需要租用處理時間，而不用投資專用的硬件。
全力以赴創新
“在一段時間內，單粒子將成為高分辨率冷凍電鏡技術的基本方法。”Yoshioka說。其他領域的進展擴大了解析結構的尺寸范圍，并允許細胞內部的視圖。
獲得小于100kDa的蛋白質的高分辨率圖像，推動了目前SPA的極限。由Tamir Gonen團隊開發的MicroED實現了尺寸范圍超過200kDa的配合物到10個碳原子以下的有機分子的原子分辨率。在加州大學洛杉磯分校工作的Gonen解釋稱，MicroED使用的晶體尺寸是X射線晶體學所需尺寸的十億分之一。在MicroED中，玻璃化作用保護了樣品，從而使單個微晶體通過電子束旋轉而產生衍射圖案，捕捉其分子三維重建的所有角度。
Gonen使用MicroED來觀察鈉離子通過通道時的結構變化。“因為我們使用的晶體只包含大約1000個單元，我們可以梳理出較小的差異，并捕捉到過渡態。”
藥物化學家、法醫學家和藥物開發人員都對MicroED“粉末到結構”的應用感到興奮。Gonen的研究小組和其他研究人員發表了一種30分鐘內通過結構（包括混合物）識別小分子（如布洛芬或生物素）的方法。
Gonen與賽默飛世爾科技公司合作開發了相對易于使用的MicroED硬件和軟件。“現在你不需要知道太多，就可以將樣本放入‘范圍’并收集數據。它可以讓學界更容易獲得MicroED。”他說。賽默飛世爾科技公司產品營銷總監Steve Reyntjens表示，MicroED套件很容易作為一個可選項目添加到新顯微鏡上，或作為現有儀器的改裝件。
加州大學洛杉磯分校的David Geffen 醫學院有一個MicroED中心，其與學術和行業科學家合作并提供MicroED培訓，包括在2020年10月舉行的年度峰會上提供培訓。
Villa指出，Cryo-ET揭示的細胞內容并不像教科書或視頻中出現的那樣“有一個空的空間，一個粒子，然后是空的空間”，它顯示細胞中充滿了分子。
TEM需要比大多數細胞更薄的樣品，所以像Villa這樣的研究人員將cryo-ET與聚焦離子束（FIB）微加工技術結合起來。Villa認為紐約州衛生部的Mike Marko證明了這種典型的材料科學方法對玻璃化樣品是可行的。作為馬克斯•普朗克生物化學研究所Wolfgang Baumeister實驗室的博士后，Villa幫助推動了這項技術的發展。
Cryo-FIB使用一種特殊的冷凍電鏡儀器，該儀器將一束大型離子束對準玻璃化樣品以使其平整。“從細胞的頂部和底部進行爆破，直到細胞側面有一個足夠薄的窗口，就可以進行cryo-ET。”Villa說。
Villa的實驗室在cryo-ET中添加了相關的光電子顯微鏡（CLEM），以確定LRRK2的14-Å結構。研究人員標記了這種與帕金森病有關的蛋白質，以使用CLEM將其定位到細胞中。然后，他們使用FIB對細胞進行細化，以獲得LRRK2的原位3D結構，包括其與微管密切相關。LRRK2不能結晶，“但通過cyro-ET和亞斷層圖像平均，我們解決了它在細胞中的結構問題”，Villa說。
根據Villa的說法，未來對cyro-ET技術的改進包括在誘導改變之前，開發專門的TEM網格來培養細胞。Villa指出，使用光學顯微鏡的研究人員可以選擇何時將樣本玻璃化以進行cyro-ET實驗，以高分辨率觀察你對細胞進行某些操作時發生的情況。
cyro-ET的樣品制備是低通量的，但是歐洲分子生物學實驗室John Briggs小組開發的一種具有多重熒光標記的CLEM變體可以更快地識別cyro-ET細胞。Nissen說，cyro-ET將允許在其原生環境和整個組織中觀察分子，例如神經元間相互作用的“連接體”的分子視圖。
美國國立衛生研究院將很快啟動國家cyro-ET中心。Carragher解釋道，當前的冷凍電鏡中心會在用戶準備好cyro-ET樣本時收集斷層掃描圖。國家中心將提供設備使用權，并協助進行棘手的cyro-ET標本制備。
除了像CLEM這樣的發展之外，結合冷凍電鏡技術和來自多個來源數據的結構分析正在興起。“人們越來越多地使用晶體學、核磁共振、CLEM、質譜等各種方法來得到答案。但如果我們希望每個人都能擁有這些工具，它們就需要更容易獲得。” Carragher說。
新的抱負
Nissen觀察到，在解決訪問問題的同時，該領域應該將其視角從只關注結構轉變為詢問結構在其原生狀態下在細胞中的作用。“在自然環境中獲得無標簽、時間解析的結構是我們的最終目標，也是培養學生和博士后的一個新目標。”
Nissen和其他人預測，冷凍電鏡技術在開發抗體療法、小分子藥物和診斷方面的工業應用將會越來越多。“我們還應該與醫學界合作，解決尚未滿足的診斷需求。在這些需求中，組織學無法顯示出疾病組織和健康組織之間的良好區別，我們可以通過使用cryo-ET來發現組織中的分子差異。”
van Heel幫助開發了冷凍電鏡技術，并目睹了它的使用增長。他在談到該領域工作時指出：“目前這很具有挑戰性，這是一個偉大的生存時代，沒時間度假了。”■
參考文獻
1.Y. Cheng, Science 361, 876–880 (2018), doi: 10.1126/science.aat4346
2.A. A. Herzing, D. M. DeLongchamp, Matter 1, 1106–1107 (2019), https://doi.org/10.1016/j.matt.2019.10.015
3.J. Frank, Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 778–785 (2012), https://doi.org/10.1016/j.sbi.2012.08.001
4.M. A. Herzik, M. Wu, G. C. Lander, Nat. Comm. 10, 1032 (2019), https://doi.org/10.1038/s41467-019-08991-8
5.E. Hand, Science 367, 354–358 (2020), https://doi.org/10.1126/science.367.6476.354
6.S. Liu, T. Gonen, Commun. Biol. 1, 38 (2018), https://doi.org/10.1038/s42003-018-0040-8
7.C. G. Jones et al., ACS Cent. Sci. 4, 1587–1592 (2018), https://doi.org/10.1021/acscentsci.8b00760
8.UCLA First Annual MicroED Summit, https://cryoem.ucla.edu/summit
9.R.Watanabe et al., bioRxiv 1–22 (2019), https://doi.org/10.1101/837203
Chris Tachibana 是生命科學領域的自由撰稿人。
鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發布在2020年3月20日《科學》雜志”。官方英文版請見https://www.science.org/content/article/democratizing-cryo-em-broadening-access-expanding-field。