縱觀生物成像的歷史，科學家和工程師為看得更多攜手并進。有時，取得進步，我們得以用更高的分辨率來觀察事物；有時他們幫助我們更深入地觀察樣本。然而，生物學家希望同時做到以上兩方面，促進了新的方法，如多光子顯微鏡的誕生。
在共聚焦顯微鏡下，單個光子激發樣品中的熒光標記。在雙光子顯微鏡（多光子顯微鏡的最常見形式）中，標記幾乎在同一瞬間吸收了兩個光子。多光子顯微鏡還使用波長更長的光子，它們能量較低，穿透力更深，在對更遠的樣本成像時對組織的損害較小。
隨著生物技術的改進，或新方法的發展，解析生物樣本中深層結構的能力不斷發展，同時在制備，操作和分析方面仍需要相當多的專業知識。在許多方面，科學進步的這兩個關鍵要素（技術和工藝）正協同發展，有助于成像揭示更多的生物世界。
技術整合
科學家們需要商業平臺來擴大多光子成像的使用范圍。尼康公司的A1R HD多光子共聚焦顯微鏡就是其中之一。該公司位于紐約市梅爾維爾。這款顯微鏡的一個主要特點是以每秒30幀的速度采集整個視場的數據。尼康公司生物系統的產品經理Adam White說：“有了A1R HD，科學家可以高速捕捉高質量的圖像”。
蔡司公司（德國奧伯科亨）生產的LSM 880 Airyscan能夠提供多光子成像。蔡司公司決策部經理和應用開發工程師Joseph Huff說。“加入Airyscan探測器可將信噪比提高4至8倍，在小鼠大腦上使用這種設置，我們可以獲取深度達500微米的數據。”
然而，深焦會有一些弊端。奧林巴斯產品經理Carlo Alonzo說：“隨著深入組織，球面像差的數量會增加。“這不僅會降低焦距，導致分辨率降低，而且由于多光子激發的效率降低，圖像也會變暗。”
為此，奧林巴斯開發了TruResolution物鏡。Alonzo解釋：“電動光學校正環可根據顯微鏡的z焦點動態調整，” 通過使這一過程自動化，這些物鏡提供了一個體積圖像，可以更好地保持從頂部到底部的z-stack亮度和分辨率。該物鏡可與奧林巴斯FLUOVIEW FVMPE-RS多光子顯微鏡一起使用，安裝簡便。使用該設備，研究人員可以更輕松地捕獲組織深處的細小特征，例如神經元上的亞微米大小的樹突棘。
捕獲透明組織
不僅提升硬件可以改善深部組織成像，組織透明技術也可以。它可使樣品幾乎透明，從而使得在更深層次的成像變得更容易。
Visikol公司（位于新澤西州懷特豪斯站）的首席科學官Tom Villani指出，除了讓光子進入組織更深處，“許多清除劑可以穩定熒光團，這是有用的副作用。”另外，Visikol HISTO透明劑易于使用。“我讓高中實習生清除組織！” Villani說。
組織類型會影響過程。 Villani說：“大腦，皮膚和肺部都很容易，但是腎臟和肝臟等色素豐富的組織更難。”顯微鏡也很重要。在幾乎任何共聚焦范圍內，都可以在Visikol HISTO清除的組織中1~2 mm處獲得圖像。他說：“你需要雙光子或光片熒光顯微鏡和水浸物鏡才能超過4毫米深度。”
為了從透明化樣品中獲得特別清晰的圖像，尼康開發了一種新的20倍甘油浸沒物鏡。它具有較高的數值孔徑（1.0）和良好的工作距離（8.2 mm）。為了達到這種清晰度，物鏡必須很大：它的長度為90毫米，直徑為48毫米——兩者的尺寸均比平均20倍的物鏡大50％。
蔡司的Lightsheet Z.1顯微鏡適用于透明化樣品。Huff說：“對于大塊組織成像，組織透明化試劑和光片是不錯的選擇。”該成像平臺包括從右側和左側的照明路徑。因此，蔡司光學顯微鏡北美產品營銷小組經理Scott Olenych說：“您可以看到實時成像的共焦深度是原來的兩倍。”盡管增加了深度，使用光片技術的真正好處是速度。“相比之下，共焦成像相當慢，” Olenych解釋說。“光片可以穿過幾毫米甚至更深，因為它使用照相機而不是光電倍增管。”
描繪發病機制
在加爾維斯頓的德克薩斯大學醫學分院，內科教授Joan Nichols和她的同事使用多光子顯微鏡研究人類疾病的發病機制。疾病過程通常涉及細胞和細胞外基質（支撐細胞的支架）的變化。為了了解這些過程，Nichols樂于對基質以及產生和修改基質的活細胞的變化進行成像。她說：“在基質中，多光子的效果驚人。它可以讓你做一些深層的成像：在100微米或更高。”從這個深度，她可以更好地評估組織，細胞和支持胞外基質中發生疾病驅動的變化。她說：“我們可以同時做控制組和實驗組，并在選定的時間段內反復成像。”
這項工作的關鍵是在疾病發展的過程中將目光投向同一個地方。使用傳統的光學顯微鏡，樣品可固定并逐片成像。Nichols解釋說“但是隨著時間的推移，在沒有固定組織的情況下觀察控制組和實驗組的組織可以讓你看到實時的變化——反復到同一個點去尋找那個區域的變化。”
Nichols和她的同事研究的疾病是肺纖維化。為此，他們通過制作3D培養的細胞（類器官）來開發生物工程化的肺組織，模仿人體器官的特征。這種類器官可以用多光子顯微鏡成像，以比較并分析健康和纖維化或病變的組織。
“通往大腦的‘窗口’”
但有時光有類器官還不夠。在瑞士蘇黎世大學，神經科學教授Sebastian Jessberger利用多光子顯微鏡研究活體小鼠的大腦，以了解哺乳動物的海馬體是如何在整個生命周期中產生神經元的，尤其是在一種被稱作齒狀回的結構中。此前，Jessberger曾研究固定細胞，但他希望有更好的方法來研究神經元的產生。因此，通過精心的手術，Jessberger將海馬體暴露在腦部，并在大腦中制造了一個“窗口”，可以在小鼠繼續表現出正常行為范圍的幾個月甚至幾年間內，用于實時成像。
Jessberger標記小鼠的干細胞，并通過多光子顯微鏡追蹤這些細胞。他解釋說：“我們觀察了出生在成年海馬體中的神經元和在胚胎發育中的神經元，由此試圖了解在細胞水平上發生了什么。”到目前為止，該技術的成像深度達到約1毫米。
Jessberger希望使用三光子顯微鏡（由Chris Xu和紐約州伊薩卡市康奈爾大學的Xu研究小組共同開發）看到可能是2毫米或更深的范圍。他說：“最終，我們希望能夠在不去除部分皮質的情況下到達齒狀回或海馬體。”
有了這些進展，Jessberger和他的同事們期望探索大腦發育的更多方面。例如，稱為少突細胞的膠質細胞將髓磷脂添加到某些神經元的外面，從而提供絕緣作用，加速電信號在這些細胞中的流動。Jessberger希望能長期追蹤這些細胞。他說：“也許我們可以學會預測哪些細胞可以脫髓鞘，哪些細胞不能。”這可以幫助科學家更好地理解多發性硬化癥等疾病，這些疾病源于髓鞘形成缺陷。
LaVision BioTec（德國貝吉施格拉德巴赫Miltenyi Biotec公司）的科學家對三光子顯微鏡的價值表示贊同。LaVision BioTec的高級產品專家Rafael Kurtz說： “由三個光子引起激發時，雙光子激發給深層組織成像帶來的巨大優勢將成倍增加。我們證明了三光子激發在各種不同組織中進行深層組織成像的優勢。”
一種好處是能夠穿透骨骼，這可以改善大腦研究。Kurtz指出：“到目前為止，必須在頭骨上切開一個窗口，才能實現腦部顯微成像，三光子成像由于其出色的骨骼滲透能力，現在可以對大腦活動進行全顱成像。”
另一個優點是骨成像本身就是三光子顯微鏡的一種應用。LaVision BioTec公司的科學家利用三光子成像和1700納米左右的激發，用“紅色熒光染料和THG(三次諧波產生)信號創建了清晰的圖像，其深度幾乎是經典雙光子顯微鏡所達到的兩倍”。Kurtz說：“造血，干細胞遷移和免疫學記憶的關鍵步驟隱藏在骨髓深處。用三光子顯微鏡對骨髓進行長期的腔內成像將有助于探索這些問題。”
發揮作用
多光子顯微鏡比過去容易得多，但它與常規的光成像有很大的不同。Jessberger說：“它不像一個普通的共焦，你買了放在工作臺上，它就可以工作，你需要一個了解物理學且至少可以部分使用的人。并且它還需要時常進行調整。”
Nichols對于需要專家協助表示認同。她說：“我們要與一個外部團隊密切合作，幫助我們設置成像和評估，大多數科學家需要依靠顯微鏡專家與他們合作。”事實上，多數大型大學也都雇傭了專門從事多光子顯微鏡研究的內部人員。
Nichols提到了多光子用戶面臨的另一個挑戰：可用性。有些設施將配備一些儀器，但并非總是如此。
僅僅想要多光子成像是不夠的。科學家還需要購買或預約要用的儀器，培養這種類型成像所需的技能，并學會準備樣品以獲得最佳結果。
創建組合
最大的進步可能來自于將先進的成像技術與其他技術相結合。例如，Jessberger描述了他的小組在對相同細胞的克隆或集群進行成像，然后觀察其RNA的方法。他說：“你可以利用這些細胞中RNA含量的知識，然后在一定時間內追蹤這些細胞的確切歷史記錄。”他補充說，這些類型的研究開始將分子機制與一系列解剖學變化聯系起來。
Nichols還結合技術研究肺功能。她利用顯微計算機斷層掃描技術來觀察整個肺部的呼吸樹，并利用多光子顯微鏡來觀察細胞層面的結構變化。
生物學家才剛剛開始探索多光子顯微鏡技術，具有清除技術的深層組織成像以及其他技術的可能組合。當然，隨著越來越多的科學家加入，這些成像技術將會有更廣泛的用途，也會有意想不到的發現。■
（譯者李楠是中國科學院深圳先進技術研究院副研究員）
作者Mike May 是美國德克薩斯州的自由撰稿人。
鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發布在2019年3月22日《科學》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2019/03/shedding-light-deep-tissue-multiphoton-microscopy。