在21世紀之初，成本的急速下降和技術的飛速發展促使許多科學家爭先恐后地對DNA進行測序。基因組學領域蓬勃發展，眾多類型的生物完整的基因組序列都被公布于眾。雖然現在基因組測序已成為日常性的工作，但由此產生的大量DNA數據并不足以完全解釋生物學家研究的許多現象。
一個同樣的基因組是如何產生復雜生物體中的所有細胞的？癌細胞通過開關哪些基因來逃避在其生長過程中的正常檢查？淋巴細胞如何對病原體作出反應，以及病原體如何逃避這種反應？要回答這些問題，需要通過測序和跟蹤基因組產生的RNA轉錄本的變化從而更深入地研究細胞信息流。
但RNA比DNA更難研究：它很容易降解，必須逆轉錄來對接大多數測序技術。不同基因的轉錄本也有著巨大的差異。幸運的是，研究人員和實驗器材試劑供應商一直在穩步改進RNA測序工具，為迅速發展的轉錄組學領域提供動力。隨著技術的進步，科研人員們越來越多地研究單個細胞內的RNA變化，在全新水平上觀測了細胞行為。
原位的真實
RNA測序的歷史是一個關于穩步提高的分辨率的故事。十年前，大多數轉錄組學研究人員從細胞群體中批量分離RNA，然后使用逆轉錄酶和標準DNA測序技術來揭示每個群體的平均轉錄組。今天，這一領域已經在很大程度上轉向單細胞RNA測序，使用各種技術來分離和標記單個細胞，然后為每個細胞生成單獨的轉錄組圖譜。利用這種方法，研究者已經發現基因表達在細胞間存在顯著差異，而這些群體在之前還被認為是具有同質性的。
2014年，位于哈佛大學的維斯研究所的研究人員更進一步，對細胞中的RNA進行了原位測序，以準確顯示哪些細胞在完整的組織切片和培養板中轉錄了哪些基因。這項技術需要將細胞的RNA固定在適當的位置，然后直接在固定的樣本上執行逆轉錄、擴增和測序步驟。由于測序過程使用了四個堿基的熒光標記，研究人員可以在熒光顯微鏡下拍攝每一步，用計算機處理圖像，并繪制出每個細胞中出現的RNA序列。
“它做的是市面上很多新一代測序儀做的事情；但它不是在流體腔里做，而是在樣品自身內部做”。 維斯研究所合成生物學平臺的首席高級研究員Richie Kohman說。
Kohman和他的同事們現在正在眾多項目中使用這項名為“熒光原位測序”(FISSEQ)的技術。在一項工作中，研究小組使用基因工程病毒為單個小鼠神經元分配獨特的標簽，然后執行FISSEQ來檢測病毒RNA并繪制動物神經元連接的圖譜。另一個項目使用基因編輯載體來產生細胞RNA標簽，隨著老鼠從胚胎發育到成年，這種標簽會隨著時間的推移而變化。在這些小鼠身上進行FISSEQ應該可以讓研究人員追蹤每一個細胞在發育過程中的聯系。
“盡管FISSEQ比在分離的細胞中測序RNA明顯產生更深層次的數據，但FISSEQ更難掌握。你必須將RNA轉換成DNA，然后你必須讓DNA形成一個環，然后你才能進行擴增；所以做這件事所需的所有化學過程需要大量的工作”。Kohman說。他還補充道：“實際的測序有其本身的一系列挑戰，但由于高通量測序技術的發展，這也對解決問題有一定程度的助益。”
FISSEQ需要標準的熒光顯微鏡設備和在顯微鏡載物臺上控制流過樣品的復雜系統。流體控制系統在商業上是可以買到的，但對于不是專門研究顯微鏡的實驗室來說，它們的價格可能太高了。FISSEQ產生的龐大數據集也需要復雜的生物信息學工具來分析。為了解決這些需求，維斯研究所的團隊成立了ReadCoor公司，該公司計劃向研究人員提供FISSEQ產品和服務。
微小的空泡
許多研究人員不需要原位技術提供的空間細節，特別是在免疫學等細胞天然就自由漂浮的領域。對于這些科學家來說，多家供應商提供的系統使單細胞RNA測序變得非常容易。在這些公司競爭的同時，他們也在不斷改進自己的產品。
例如，位于加州普萊森頓的10X Genomics公司是用戶友好型單細胞RNA測序技術的先驅之一。要使用該公司的系統，研究人員只需將懸浮細胞的樣本加載到一個專門的微流控芯片上。微流控裝置將樣本分離成數千個微小的液滴，每個液滴包含一個細胞和一個凝膠珠。這些珠子帶有獨特的寡核苷酸條形碼。然后，這些液滴經過標準的逆轉錄和測序，產生一個數據集，在這個數據集中，每個細胞的完整轉錄組都與其各自的條形碼相連。該系統附帶的軟件可以讓研究人員瀏覽和可視化數據，或者他們也可以將數據導出，用自己的算法進行處理。
最初的10X系統側重于單細胞RNA測序，但新版本增加了同步DNA測序和染色質分析。10X公司首席科學官兼聯合創始人Ben Hindson說：“我們增加了這一功能來觀察蛋白質的表達，我們可以對抗體或其他可能與細胞相互作用的蛋白質進行條形碼編碼，并在觀察基因表達的同時將其讀出，可能還包括它們特定的DNA克隆類型。”
在該系統當前的技術水平上，在一個給定的實驗中，研究者可以同時觀察特定細胞的兩個特征，例如，跟蹤淋巴細胞表面蛋白質的表達和同一細胞的RNA轉錄組。Hindson預計，未來的系統將允許更多的同步分析，從每個細胞中提取更多數據。他說：“當我們展望這一領域的未來時，從一次運行中獲得盡可能更多的信息順理成章。”
微流控系統的速度使研究人員能夠研究大量的單細胞。每個芯片有八個通道，每個通道可以容納1萬個單元，每次運行的潛在通量為8萬個細胞。的確，該公司已經展示了在短短幾天內分離、條形碼編碼和測序100多萬個細胞的完整轉錄本的能力。
然而，雄心勃勃的計劃著復制這種巨大成就的研究人員們，應該準備好迎接一些來自價格方面的沖擊波。Hindson解釋說，雖然10X系統本身的定價符合學術資本預算和撥款建議，但每個細胞中每個RNA分子的測序成本隨著實驗規模的擴大而迅速上升。
幸運的是，一旦細胞被分離并進行條形碼編碼，研究人員就可以決定他們的實驗所需的測序水平。只想將細胞分類為特定類別的免疫學家，可能只需要對更多細胞較少的測序讀數；而致力于新發現的分子生物學家可能會需要在更少的細胞上獲取更多的測序讀數。
幾率的游戲
其他制造商也提供單細胞測序工具，每家公司都有自己的細胞分選和條形碼編碼策略。專家建議剛剛開始進行RNA測序的科研人員仔細比較這些選項，因為它們有不同的優點和局限性。
實驗儀器和試劑巨頭BD Biosciences使用一種簡單但穩定的細胞條形碼編碼方法，該方法基于一種稱為泊松分布的統計現象。在該公司的Rhapsody細胞索引系統中，實驗人員將每個樣本稀釋至包含約2萬個自由漂浮細胞，然后將樣本裝載到一個包含20萬個微孔的特殊設計的盒子中。在每孔只稀釋0.1個細胞的情況下，泊松分布意味著含有細胞的孔有可能只有一個單細胞。然后，研究人員將標記了寡核苷酸的珠子裝載到盒子中，每個珠子都帶有一個獨特的條形碼，條形碼上有一個多聚腺苷化標簽，可以與mRNA結合。
新澤西州富蘭克林湖BD公司的應用市場高級總監Stephen Kulisch解釋說，這些孔的設計使得它們實際上只能容納一個細胞和一個珠子，所以任何多余的珠子都可以通過簡單的洗滌從盒子中洗掉。一個可選配的成像系統允許調查人員檢查這一過程的效率。Kulisch說：“你可以對這個陣列進行成像，得到關于多方位的一些非常好的統計數據，以及你捕獲了多少個細胞，你有多少個珠子與細胞的組合。”
一旦單個細胞與條形碼珠子完成配對，該系統遵循與其他RNA測序方法相同的一般路徑—裂解細胞，逆轉錄RNA，然后對得到的DNA進行測序。因為DNA分子綁定了與它們共用一孔的多腺苷條形碼，所以該系統的軟件可以將每個序列追溯到產生它的細胞。
像10X一樣，BD也在努力從每個細胞中提取更多的數據。該公司現在提供了一系列用自己的分子條形碼標記的抗體。通過再將裝入Rhapsody試劑盒之前的細胞，與這些抗體孵育，科研人員可以從同一細胞中獲得完整的轉錄組序列和蛋白質表達數據。
雖然熒光激活的流式細胞分選儀也可以進行單細胞蛋白質標記，但BD系統極大地擴大了人們可以在實驗中使用的標記數量。Kulisch說：“這項技術與流式細胞術相比的優勢在于，你可以做非常多的靶點。”他補充說，“我們已經在細胞內部同時標記了40個蛋白質，但合作伙伴甚至在同時做多達100個蛋白質。”流式細胞儀受限于它們可以追蹤的熒光顏色的數量，通常每次只能追蹤幾種。
對于沒有細胞分選儀的實驗室來說，條形碼編碼的抗體也更容易使用。Kulisch估計，完整的Rhapsody系統可以安裝在實驗臺上，并在交付后幾個小時內運行，而沒有成像選項的系統“幾乎就像凝膠切割平臺一樣容易安裝”。與10X系統一樣，Rhapsody的定價也符合各個實驗室的預算，持續費用主要由測序花銷來體現。
年輕人，要驗證蛋白質水平
通過檢測蛋白質水平來驗證單細胞RNA測序結果正在迅速成為標準做法。他說：“我們看到很多客戶都在使用10X儀器，或者類似的儀器和方法，現在他們基本上都在進行下一步的蛋白質驗證，這是審稿人和出版商要求的，“加州圣何塞ProteinSimple的營銷總監Kelly Gardner說。
Gardner銷售的名為Milo的產品將蛋白質追蹤發揮到了邏輯層面的極致：單細胞Western分子印跡，即使是最挑剔的第三方審稿人也會滿意。該系統由一塊上面有一層薄聚丙烯酰胺凝膠的玻璃片組成。超過6000個微孔中點有這種凝膠。與BD平臺和其他平臺類似，Milo使用泊松分布和受控加載來分發細胞。加德納說：“很多孔都是空的，而有些孔只有一個細胞。”
細胞一旦被放入，載玻片就會進入臺式的Milo儀器，該儀器裂解細胞，對蛋白質進行凝膠電泳，然后在凝膠中使用一種專有的、紫外線激活的化合物來使蛋白質在原位發生交聯。這消除了傳統Western分子印記轉膜步驟中固有的蛋白質損失，并達到了在單細胞中探測蛋白質所必需的靈敏度。之后，這一過程就像標準的蛋白質印跡一樣繼續進行，先是第一抗體，然后是熒光標記的第二抗體。最后，用微陣列掃描儀讀取結果。
Gardner說：“你最終得到了一個單細胞微陣列；我們有一個叫做Scout的軟件包，它可以拍攝所有這些圖像，檢測峰值，并量化每個單細胞的峰值面積。”目前的系統不能同時提供來自同一細胞的RNA序列信息，但Gardner說，該公司正在努力做到這一點。
同時，經過處理的Milo載玻片可以儲存長達9個月，使研究人員能夠分離樣本，平行的進行RNA測序和單細胞蛋白印記，然后比較結果。Milo系統最常見的用途是服務于那些已經在進行單細胞RNA測序，并發現需要驗證的轉錄本表達情況的研究人員。
與其他設備制造商一樣，ProteinSimple試圖讓有需要的研究人員能夠接觸到他們的產品。用戶友好性也是一個主要的關注點，Gardner說，“我們甚至有非專業研究人員已經開始進行測試，在他們第一次接觸儀器時就已經開始了。”
無論他們使用何種方法，該領域的專家們一致認為，單細胞RNA分析正在推動一波巨大的探索浪潮。“似乎每周都有新的論文出現在高水平期刊上，他們有一個新穎的解決方案，提供了一個新的視角。”Hindson說。■
參考文獻
1. Lee et al ., Science 343, 1360–1363 (2014).
（譯者李楠系中國科學院深圳先進技術研究院副研究員）
作者Alan Dove 是常駐馬薩諸塞州的科學作家和編輯。
鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發布在2019 年2 月21日《科學》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2019/02/shotgunning-messenger-single-cell-rna-sequencing。