1983年5月，當(dāng)時還在加州埃默里維爾的Cetus 公司擔(dān)任研發(fā)人員的Kary Mullis合成了一些寡核酸片段，隨后將它們與少量的模板DNA混合，并加入一種聚合酶及其他試劑。經(jīng)過一系列的孵育后，正如Mullis所愿，聚合酶已經(jīng)通過一個鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將模板復(fù)制了許多次。
Mullis最終脫離了科學(xué)主流，Cetus經(jīng)歷了一系列并購，但PCR依然存在。就像它靶向的DNA模板不斷擴(kuò)展，PCR技術(shù)已經(jīng)被復(fù)制、擴(kuò)增并傳播到世界各地的實驗室。專用的熱循環(huán)儀和相關(guān)工具席卷市場，供應(yīng)商出售各種各樣的熱穩(wěn)定聚合酶，世界各地的大學(xué)生在生物學(xué)入門課程中學(xué)習(xí)這項技術(shù)。
PCR已經(jīng)有35年的歷史了，它已經(jīng)成為一種無處不在的實驗室工具。盡管如此，研究人員、工程師和醫(yī)生仍在努力尋找將其推向新領(lǐng)域的方法。從這些努力中的一些案例上可以看出，PCR的應(yīng)用范圍已經(jīng)擴(kuò)大到空前的程度，從奶牛場到診所，從教室到外太空。
發(fā)射出去的序列
PCR所需的主要硬件是熱循環(huán)儀，這是一種能夠快速加熱和冷卻樣品管的機(jī)器，并能在特定的時間內(nèi)將樣品管保持在精確的溫度。盡管三十年的發(fā)展和競爭極大地改進(jìn)了這些機(jī)器，但它們?nèi)匀幌鄬Ρ恐亍⒑碾姾桶嘿F。因此，作為現(xiàn)代分子生物學(xué)的一項關(guān)鍵性技術(shù)，PCR仍然無法為一些教育工作者所使用，在許多偏遠(yuǎn)地區(qū)也無法使用。
“PCR是最重要的研究技術(shù)之一，但因為設(shè)備的規(guī)模和成本，它也是最受限制的技術(shù)之一。尤其當(dāng)你在實驗室之外時，”位于馬薩諸塞州坎布里奇的MiniPCR公司的遺傳學(xué)專家和共同創(chuàng)始人Zeke Alvarez-Saavedra這樣說。傳統(tǒng)的PCR儀不便移動，出于對這一特點的失望，2013年，Alvarez-Saavedra與分子神經(jīng)生物學(xué)專家Sebastian Kraves合作，研制了一種便攜式熱循環(huán)儀。
大多數(shù)熱循環(huán)儀使用Peltier結(jié)來控制溫度，Peltier結(jié)是一種能夠在加熱和冷卻之間快速切換的熱電裝置。不幸的是，Peltier結(jié)效率低下，操作這些結(jié)點所需的元件使熱循環(huán)儀變得笨重且耗電量大。
Alvarez-Saavedra和Kraves采用了不同的方法，他們使用一種薄膜電阻加熱器加熱樣品，類似于汽車上常見的車窗除霜器。為了冷卻，團(tuán)隊使用了一個簡單的風(fēng)扇。微控制器驅(qū)動加熱、冷卻和孵育周期。更簡單的設(shè)計使得機(jī)器比普通的熱循環(huán)儀更小更輕，也帶來了其他好處。“當(dāng)你把東西做的更小，它的零件更少，且耗電更少……這有助于降低成本，” Alvarez-Saavedra說。
正如他們所希望的，低成本的小型PCR系統(tǒng)立即吸引了學(xué)校客戶。Kraves說：“在我們成為科研人員的過程中，直到讀完高中還沒有接觸過生物技術(shù)，這對我們來說是一種痛苦，所以我們想要消除一些障礙。” 公司還開發(fā)了一種小型、簡單的瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)作為配套產(chǎn)品。一個包含熱循環(huán)儀、凝膠系統(tǒng)和配件的完整的工具包只賣不到1000美元，將它控制在了許多學(xué)校的預(yù)算之內(nèi)。
盡管學(xué)校已經(jīng)成為MiniPCR的主要市場，其他行業(yè)也迅速采用了這一平臺。Kraves說，野外研究人員、動物育種專家和食品公司都逐漸采用了這個系統(tǒng)，他們發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)場進(jìn)行自己的PCR檢測，要比把樣品送到遠(yuǎn)程實驗室更便宜，也更快捷。
然而，最令人驚訝的電話來自國際空間站上的工程師。“我們從來沒有專門要把這項技術(shù)設(shè)計成太空友好型的，所以當(dāng)太空機(jī)構(gòu)告訴我們它非常適合太空飛行時，我們感到特別驚訝，” Kraves說。MiniPCR系統(tǒng)現(xiàn)在是競賽“太空中的基因”的核心組成部分，中學(xué)生們提出基于PCR的實驗，然后由空間站上的宇航員在微重力環(huán)境下進(jìn)行。
智能手機(jī)上的PCR
MiniPCR是第一家將PCR應(yīng)用于太空的公司，但他們并不是唯一一家試圖使這項技術(shù)更便宜、更便攜的公司。韓國首爾的Ahram Biosystems在銷售的Palm PCR微型化熱循環(huán)儀，類似于MiniPCR裝置。與此同時，位于賓夕法尼亞州費城的Biomeme公司將便攜式PCR的理念提升到了一個新的高度，將其擴(kuò)展到實時PCR。
在實時或定量PCR（qPCR）中，實驗人員使用熒光標(biāo)記物連續(xù)監(jiān)測PCR擴(kuò)增的進(jìn)展。通過測量新的DNA拷貝出現(xiàn)的速率，研究人員可以計算出初始樣本中有多少模板分子。他們也可以直接從PCR反應(yīng)管中讀取結(jié)果，而不需要瓊脂糖凝膠電泳。然而，所有這些監(jiān)測和計算都需要大量的計算能力和額外的設(shè)備，使得qPCR比標(biāo)準(zhǔn)PCR更加復(fù)雜和昂貴。
Biomeme公司的聯(lián)合創(chuàng)始人Marc DeJohn、Jesse van Westrienen和Max Perelman認(rèn)為，一種不相關(guān)的趨勢可能有助于讓qPCR走出實驗室。van Westrienen說：“我們想到，每個人口袋里都有一部智能手機(jī)，但卻從沒見過他們用它來做分子診斷。”在解決與MiniPCR公司同樣面臨的熱循環(huán)儀工程問題時，Biomeme公司還解決了通過智能手機(jī)應(yīng)用程序添加光學(xué)傳感器的難題，該應(yīng)用程序既可以控制和監(jiān)控qPCR反應(yīng)，也可以用于對樣品制備所需的耐貯存試劑的管理。
對于現(xiàn)場使用來說，“準(zhǔn)備樣本可以說是最困難的事情，我們從一開始就致力于開發(fā)一種非常簡單的產(chǎn)品，不需要任何專業(yè)知識或特殊的實驗室設(shè)備。” van Westrienen這樣介紹。結(jié)果是一個針對不同應(yīng)用的試劑盒目錄，每個試劑盒都有凍干試劑和在樣管中預(yù)先測量的引物。
Perelman說，通過使用該公司的相應(yīng)試劑盒，一個受過最低限度培訓(xùn)的實驗人員可以在幾分鐘內(nèi)將一份原始樣品制備成一套qPCR反應(yīng)樣品，為熱循環(huán)做好準(zhǔn)備。這臺機(jī)器本身有一個與標(biāo)準(zhǔn)智能手機(jī)連接器兼容的基座。Biomeme公司基于網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)端口可以存儲由此產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)，研究人員可以在線分析這些數(shù)據(jù)或?qū)⑵湎螺d到自己的電腦上。
目前的Biomeme系統(tǒng)售價4000美元，比MiniPCR的系統(tǒng)貴很多，但是Perelman認(rèn)為它提供了額外的功能：“你可以在一個小時內(nèi)完成所有的工作，只需在應(yīng)用程序中向左或向右滑動，就能實時看到擴(kuò)增的效果。”Perelman還補(bǔ)充說，該公司目前正在與國防和執(zhí)法部門的用戶，以及野外作業(yè)科研人員和食品公司合作。
快的和死的
雖然便攜式PCR技術(shù)正在迅速擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，但世界各地的研究人員仍在以無數(shù)漸進(jìn)的方式推進(jìn)其能力的拓展。區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌的問題為此提供了一個很好的例子。
PCR對于檢測核酸序列是非常敏感和特異的，但是僅僅知道一個特定的DNA或RNA序列存在，并不能證明它與一個活的生物體有關(guān)。這是食品工業(yè)的一個主要問題，是否巴氏滅菌的食品中都會通過PCR檢測出病原菌陽性，盡管前者的細(xì)菌是安全的死亡的，而后者的細(xì)菌是危險的存活的。因此，食品實驗室長期以來依賴于相對緩慢、繁瑣的培養(yǎng)試驗來進(jìn)行最終檢測。
開發(fā)出只能進(jìn)入死細(xì)菌的DNA交聯(lián)劑是該領(lǐng)域的第一個重大進(jìn)展。交聯(lián)可以防止死細(xì)菌的DNA在隨后的PCR反應(yīng)中被擴(kuò)增。第一代試劑使用很不方便，需要暗室和冷庫。最近，日本奈川縣森永乳業(yè)的Takashi Soejima和他的同事開發(fā)出了一種穩(wěn)定、耐光的化合物，同樣以死細(xì)菌為目標(biāo)。該團(tuán)隊最近的工作涉及鈀基試劑，這些試劑選擇性地干擾了來自死亡而非活細(xì)菌的DNA通過PCR擴(kuò)增。將鈀試劑與qPCR相結(jié)合，產(chǎn)生了一種可以取代舊的、更昂貴的技術(shù)，簡化了乳制品和其他食品設(shè)施生產(chǎn)的測試方法(1)。
用于癌癥診斷的液滴
研究人員和設(shè)備制造商也借鑒其他領(lǐng)域的技術(shù)，對PCR進(jìn)行了更徹底的修改。其中一項成果是液滴數(shù)字PCR（ddPCR），它結(jié)合了熒光活化細(xì)胞分類技術(shù)（FACS）和傳統(tǒng)PCR的各個方面。雖然ddPCR的實驗流程有些復(fù)雜，但它已經(jīng)變得高度自動化。事實上，加州赫拉克勒斯的伯樂公司現(xiàn)在可以銷售完整的ddPCR設(shè)備，可以自動運行整個過程。在這些系統(tǒng)中，噴霧器將制備好的PCR反應(yīng)混合液分離成數(shù)千個納米級的液滴，然后在熱循環(huán)過程中保持液滴的獨立。每個液滴都進(jìn)行自己的一系列擴(kuò)增，然后機(jī)器用熒光標(biāo)記對其進(jìn)行分類，以檢測目標(biāo)序列。
ddPCR已被證明特別適用于檢測背景水平（非靶標(biāo)DNA）非常高的樣本中的微量靶標(biāo)，如在患者血液樣本中循環(huán)的腫瘤DNA標(biāo)志物。這項技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)穩(wěn)定。至少，位于科羅拉多州博爾德的Biodesix公司，現(xiàn)在已經(jīng)提供基于ddPCR的“液體活檢”臨床測試。Biodesix測試使用一個小血樣，可以快速識別肺癌患者腫瘤中的精確突變，讓醫(yī)生能夠為該腫瘤類型選擇最有效的藥物。
“一旦我們知道了確切的突變，就可能借助靶向療法來治療，這改變了我們治療病人的整個模式，”位于北卡羅萊納州格林維爾的東卡羅萊納大學(xué)臨床腫瘤學(xué)教授Mark Bowling說（他是該校的保羅. R.和凱瑟琳. M.赫廷格·沃克杰出教授）。雖然傳統(tǒng)的活檢分析和測序可以得到相同的信息，但Biodesix測試要快得多。“我們可以在三天內(nèi)得到測試結(jié)果，”Bowling說。標(biāo)準(zhǔn)的活檢可能需要兩周以上的時間。Bowling說，對于那些能對靶向治療產(chǎn)生響應(yīng)的腫瘤患者來說，可能是生與死的區(qū)別。
由于Biodesix是基于PCR技術(shù)，因此隨著制藥商推出更多的基因靶向療法，Biodesix測試的應(yīng)用范圍還有擴(kuò)大的空間。然而Bowling說，即使目前靶向化療藥物的選擇有限，知道病人確切的腫瘤類型，在三分之一的情況下已經(jīng)改變了他們團(tuán)隊的治療策略。
建立一個更好的循環(huán)
臨床試驗一直是PCR開發(fā)人員關(guān)注的重點，但有時這種技術(shù)的要求阻礙了它的發(fā)展。在第一份描述Mullis版本 PCR技術(shù)原理驗證的出版物上，作者展示了如何使用它來識別導(dǎo)致鐮刀型細(xì)胞特征的血紅蛋白突變(2)。不幸的是，鐮刀型細(xì)胞貧血癥流行的地區(qū)在撒哈拉以南的非洲，對于那里的許多臨床實驗室來說，PCR仍然過于昂貴。
即使PCR技術(shù)不斷拓展到新的領(lǐng)域，總有些限制促使大量研究人員開發(fā)替代它的核酸擴(kuò)增技術(shù)。這些方法中的大部分都遵循類似的原理，但具備了不同的優(yōu)勢。利用一種高速率聚合酶的多重置換擴(kuò)增，已成為基因組測序的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。而滾圈擴(kuò)增則能夠?qū)⒛繕?biāo)序列反復(fù)復(fù)制到一條單鏈DNA上，在生物化學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。
與此同時，環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）已經(jīng)成為想要在野外環(huán)境里進(jìn)行DNA測試的研究人員的熱門選擇。顧名思義，LAMP使用一種可以在恒定溫度下打開并重復(fù)復(fù)制DNA分子的聚合酶，因此無需昂貴的熱循環(huán)儀。
這對像比利時列日的LaCAR MDxTechnologies這樣的公司很有吸引力。該公司正試圖開發(fā)適用于欠發(fā)達(dá)國家的臨床檢測技術(shù)。“我們就是在尋找一種使分子遺傳學(xué)檢測更容易的方法。你可以使用一些色譜柱或者PCR設(shè)備，但是你需要昂貴的材料和復(fù)雜的技術(shù)。” LaCAR的首席執(zhí)行官Arnaud Allaer說。
該公司轉(zhuǎn)而開始采用LAMP技術(shù)，并很快發(fā)現(xiàn)它非常強(qiáng)大。除了不使用熱循環(huán)儀，該公司基于LAMP的檢測方法還可以鑒定來自新鮮或凍存血液樣本中的基因點突變，甚至是吸墨紙上的干血斑，而不需要DNA提取步驟。終于實現(xiàn)了最初PCR論文的承諾，LaCAR根據(jù)他們的發(fā)現(xiàn)開發(fā)了一種廉價、可靠的鐮刀型細(xì)胞特性測試方法。Allaer說:“我們在列日大學(xué)做了一個臨床試驗，我們也將在剛果做一個。”（3）
無論他們是在制造便攜式熱循環(huán)儀，使用先進(jìn)的PCR檢測技術(shù)快速診斷癌癥，還是探索其他技術(shù)來突破PCR的局限性，該領(lǐng)域的專家都對未來35年的DNA擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展持樂觀態(tài)度。“這是一個激動人心的時代，”Bowling說。■
參考文獻(xiàn)：
1. T. Soejima, K. Iwatsuki, Appl. Environ. Microbiol. 82, 6930-6941 (2016).
2. R. K. Saiki et al., Science 230, 1350-1354 (1985).
3. L. Detemmerman, S. Olivier, V. Bours, F. Boemer, Hematology 23, 181-186 (2018).
（譯者李楠是中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院的副研究員。）
Alan Dove是常駐馬薩諸塞州的科學(xué)作家和編輯。
鳴謝：“原文由美國科學(xué)促進(jìn)會（www.aaas.org）發(fā)布在2018年5月10日《科學(xué)》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2018/05/pcr-thirty-five-years-and-counting。
《科學(xué)新聞》 (科學(xué)新聞2019年6月刊 科學(xué)·職業(yè))