在短短20小時內，斑馬魚胚胎就從一個單細胞發育成一個擁有2萬個細胞能夠扭動尾巴的生物體。自從Philipp Keller在2005年開始讀博士時，他就想看看在如此之短的時間內這一復雜的過程是怎樣實現的。由于胚胎細胞以每秒幾微米的速度移動，他需要高速視頻來捕捉這一過程。
Keller說，激光片層掃描顯微鏡是解決這個問題的必要手段。他現在是位于弗吉尼亞州阿什伯恩附近的Janelia 科研園區的一名生物學和物理學專家。即使內部光學系統并非完全如此，激光片層掃描顯微鏡的概念其實很簡單，即一次照亮樣品的某個平面，拍攝寬場圖像，然后移動平面。這種方法比典型的共聚焦顯微鏡逐點掃描快得多。與其他技術相比，它對單個細胞造成的光毒性更小。因此，對于很多對高速細胞活動(如神經元的放電或血細胞的流動)感興趣的科研人員來說，激光片層掃描系統已經帶來活細胞成像的下一波浪潮。其他推動活細胞成像發展的技術還包括多光子顯微鏡和以拉曼顯微鏡和三倍頻成像為代表的無標記成像方式。
“活細胞成像一直都是顯微鏡的終極用途。”位于德國耶拿的蔡司顯微鏡公司的應用技術專員Christian Hellriegel這樣說。他繼續解釋，活細胞成像超越了生命的結構，而觀察生命的過程，包括細胞或分子如何移動，細胞如何對環境或鄰居作出反應，以及大腦如何運作或損傷如何愈合。
公司和科研人員們正在開發一系列的工具，所有這些選擇可以歸結為以下三種，紐約州伊薩卡的康奈爾大學的應用物理學專家Chris Xu說。“每個人都想看得更深、更快、更寬。”
更深：多光子成像
為了在顯微鏡下看得更深，一個解決方案是多光子成像，位于英國劍橋的徠卡微系統公司的首席科學官Julian Burke說。徠卡剛剛推出了SP8 DIVE顯微鏡，這是一個多色雙光子系統，可以深入觀察活體組織。訣竅是，它不再是用一個光子，而是用兩個長波長光子來激發熒光團。Burke說，在最理想的條件下，這些更紅、更長的光波可以穿透深達500微米的組織，因為它們不太容易被組織本身散射。它們的光毒性也更低，而且不容易令熒光團淬滅，他補充說。
法國勃艮第大學的化學專家David Monchaud因為多光子成像的精度、靈敏度和活細胞成像能力而被吸引。他研究DNA和RNA四聯體，這兩種核酸結構最初是通過共聚焦顯微鏡在固定的死細胞中觀察到的。利用多光子顯微鏡，他可以確認活細胞中存在四聯體，這表明它們可能在那里發揮某種功能。“這種顯微鏡是無價的，” Monchaud說。
如果兩個光子很好，那三個光子會不會更好呢？這是Xu正在研究的問題。通過利用三個波長很長的光子來激活一個熒光團，他可以更深入地觀察活體樣本。在2017年，他報道了對1毫米深處老鼠神經元放電的可視化。Xu說，這種顯微鏡可以直接通過密集的光散射白質成像，這是以前的顯微鏡無法做到的。他說，一些實驗室正在利用這項技術研究細胞遷移和神經科學等課題。
更快：激光片層掃描技術
然而，多光子成像仍然依賴于速度較慢的逐點掃描。Xu說：“速度和深度總是需要平衡的。” Keller想要在60~90秒內掃描整個斑馬魚胚胎，所以激光片層掃描顯微鏡就成為了問題的解決方案。
盡管激光片層掃描顯微鏡是一個古老的概念，蔡司顯微鏡公司的研究人員在1903年就首次提出了這個概念。但直到這個世紀，這些用于處理圖像體積的熒光標簽才開始匯聚在一起，使激光片層掃描技術成為主流。蔡司Z.1型激光片層掃描顯微鏡包括一個懸掛在物鏡前的培養槽，里面可以容納整個生物體（例如一只果蠅甚至是一只小章魚），而且可以方便地旋轉以獲得更好的視角。
Keller在2008年發明了一種被稱為數字掃描激光片層熒光顯微鏡（DSLM）的系統，使他得到了夢寐以求的速度：每分鐘15億體素。這個系統的設計不同于常規的商業化顯微鏡。Kelle將激光和物鏡以正確的角度放在臺子上；然后，他將斑馬魚胚胎植入瓊脂糖中，并將瓊脂糖置于光源和物鏡之間的試管中。他通過在激光片層中前后移動樣品，從而掃描所有平面。他觀察到了以前從未見過的斑馬魚胚胎發育和胚層形成的實例。
從那時起，Keller革新了這項技術。另一個問題是，如果樣品很大或不透明，激光片層可能無法穿透它。為了解決這個問題，Keller開發了SiMView。他將激光片層和相機加倍，在20毫秒或更短的時間內，即可收集4張圖像，因為每個相機可以快速連續地聚焦在兩張圖像上。
他解決的另一個問題是各向異性，即一個目標在橫向xy方向的分辨率通常比在軸向z方向的分辨率高。為了獲得在任意視角下具有相同分辨率的3D圖像，keller將相機和激光片層的數量再次翻倍至4個，并將這些圖像進行數字組合，形成一種名為isoview的技術。
在馬里蘭州巴爾的摩的國家生物醫學成像和生物工程研究所，顯微鏡專家Hari Shroff也對神經發育科學感興趣。他與來自康涅狄格州紐黑文的耶魯大學和紐約的斯隆—凱特琳研究所的科研人員合作，正在對線蟲大腦的發育過程進行成像。
“這些蠕蟲胚胎很難成像，而且對光線非常敏感，”Shroff說。“你真的必須要快。”
他和他的同事們想要避免經典的激光片層操作。在那種操作中，樣品被嵌入一管瓊脂糖，并被激光和照相機包圍。相反，他們更喜歡把蠕蟲胚胎放在標準的蓋玻片上。
為了保證入射的激光片層和物鏡之間的角度剛好合適，Shroff的解決方案是從垂直方向各傾斜45度。這個設備看起來很像一個標準顯微鏡，除了載物臺上那兩個傾斜的物鏡。樣品保持靜止，來自兩個不同物鏡的激光片層連續移動。該系統被稱為反向選擇平面照明顯微鏡（iSPIM）。
和Keller一樣，Shroff也處理了各向異性的問題，但是他不是通過增加更多的物鏡。他只是簡單地將它們分別設置為生成一個激光片層或收集一個圖像，并在兩者之間交替。首先，物鏡A生成激光片層，物鏡B獲取圖像，然后互換任務。研究人員稱這種布局為對稱雙視圖iSPIM（diSPIM）。
但是Shroff和他的同事們并沒有就此結束。還有另一個版本的儀器被他們稱之為三視圖SPIM，他們在蓋玻片下面增加了一個額外的物鏡，以收集額外的輸出并提高空間分辨率，而不需要增加速度和激光強度。最后，研究人員通過在一個鏡像位置的蓋玻片進行了diSPIM實驗。這就在目鏡之外創建了一個“虛擬圖像”，就好像樣品和激光片層都加倍了。通過正確的算法，Shroff和他的團隊可以從這些反射中獲取信息。其結果是在速度加倍的條件下進行更加靈敏的成像，這一切都只是因為加入了一塊鍍鋁的蓋玻片。
更寬：鮮活生動的風景
紐約哥倫比亞大學的生物醫學工程師Elizabeth Hillman開發了一種激光片層技術，這種技術只需要一個物鏡就能產生激光片層，并從樣本中收集所有信號。其樣本可以是一個完整的、自由移動的生物體。該系統使用一面鏡子收集樣品中的光和相機焦點。她將她的系統稱為“掃描同軸平面激發”（SCAPE）顯微鏡。
與其他新的激光片層掃描技術一樣，SCAPE具有速度快的優點。Hillman利用新型相機每秒可以對樣本成像100多幀。這使得她能夠對清醒的、移動的生物的細胞進行成像，比如爬行的果蠅幼蟲的閃爍神經元，或者抽搐的斑馬魚的跳動的心臟，而不會在動物移動時造成影像模糊。“我們的速度如此之快，以至于我們可以看到前所未見的時間信息。”
Hillman說，SCAPE物鏡很容易適配各種類型的樣品。這些細胞或生物體可能在培養皿中，甚至在老鼠的大腦里都沒關系。
哥倫比亞已經將SCAPE技術授權給徠卡，雖然Burke還不確定徠卡的SCAPE系統將在何時面世。徠卡還獲得了另一種掃片技術斜平面顯微鏡（OPM）的授權。這是由倫敦帝國理工學院生物醫學光學專家Chris Dunsby開發的。
Dunsby的目標是在保持良好分辨率的同時，進行單物鏡的激光片層顯微鏡實驗。他的技術使用三個顯微鏡連續放大樣品，從傾斜的平面捕捉光，并掃描激光片層。
Dunsby說，整個裝置提供了高速、亞細胞分辨率的3D成像。例如，他將其與鈣追蹤染料一起使用，在大鼠心肌細胞中觀察可能在心力衰竭時觸發致命型心律失常的鈣離子濃度風暴。“我們第一次能夠在三維圖像中看到，鈣離子波從心肌細胞中產生的具體位置。”他解釋說。
OPM也適用于多孔板。Dunsby和他的同事曾用OPM和一個熒光生物傳感器來測量多細胞腎臟模型中葡萄糖的攝取情況。對42個孔里的樣品成像只花了9分鐘。
接下來呢？
SCAPE和OPM技術非常互補，Burke說,徠卡計劃在即將發布產品上將它們合二為一。
活細胞成像的下一步是什么？Hellriegel說：“我覺得我們還沒有發掘出激光片層掃描技術的全部威力。”例如，他認為可以將超高分辨顯微技術整合到這一技術之中。
Burke預測，更多能夠標志細胞事件(如神經傳遞)的熒光蛋白和染料將使實時、快速成像對研究人員們具有巨大的吸引力。他還預計，為了進行快速成像，速度更快、靈敏度更高的相機將成為必須研發的組件。
要不要熒光標簽？
有時候，研究人員不愿使用熒光標簽。首先，將它們引入樣品就很麻煩。也很難確定熒光團是否準確地反映目標蛋白質的位置和活動。標簽可能無法有效地標記蛋白質，也可能隨著時間的推移被淬滅。
紐約城市大學亨特學院的生物物理學專家Hyungsik Lim使用三倍頻（THG）顯微鏡來對髓鞘（神經線周圍包裹的絕緣層）進行成像。這項工作是在活細胞和組織中進行的，而且不用任何熒光標簽。當三個入射光子能量結合到一個發射的光子中時，就會產生三倍頻（THG）信號。這項技術對組織邊界的折射率變化特別敏感。比如髓鞘這樣，處于水溶液和富含脂質或蛋白質之間的結構。
另一個選擇是拉曼顯微鏡，即拉曼光譜儀的掃描版。日本大阪大學的應用技術專家Katsumasa Fujita正致力于將這一技術推廣到顯微鏡領域。拉曼光譜依賴單一波長的入射光激發樣品中的不同分子。組成這束光的光子無論被樣品中的分子反彈還是折射，他們大部分會保持入射時的波長。但是通常每一億個光子中會有一個在反彈之后發生光譜紅移，即變得能量較低，頻率向紅光區靠近。光譜紅移的程度取決于令光子發生散射的分子。拉曼光譜儀就是以這種方式鑒定樣品中的組分。
在生物顯微鏡上，拉曼散射的工作原理也是相似的，它能描述一個樣品中各分子成分的分布，無論是核酸、蛋白質還是脂肪。但是，除此之外它無法進行更深入的鑒別，例如它無法對不同的激酶進行鑒別。
與此同時，紐約哥倫比亞大學的研究人員正努力將多種熒光標簽加入拉曼成像的細胞樣品中。生物物理化學專家Wei Min指出，傳統熒光成像中最多可以同時使用大約五種熒光標簽，因為熒光團的發射光波長范圍較寬，容易彼此重疊。但在拉曼光譜中，發射光的波長范圍會變得更窄，因此應該可以使用更多的熒光標簽而不發生重疊。
Min過去的博士后Lu Wei，現在是帕薩迪納市加州理工學院的化學教授。她選擇接受這一挑戰。她和她的同事們設計了24種不同的熒光染料。通過變換分子中的碳碳三鍵、碳氮三鍵，以及同位素成分，他們創造出了不同的熒光基團。
現在Wei和Min仍然在努力開發更多的熒光染料，以及利用這些熒光染料對目標生物分子或者細胞器進行特異性標記的方法。Min認為也許至少50種標簽才夠用。■
（譯者李楠是中國科學院深圳先進技術研究院副研究員。）
作者Amber Dance 是加利福尼亞州洛杉磯的自由撰稿人。
鳴謝：“原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發布在2018年3月27日《科學》雜志”。官方英文版請見https://www.sciencemag.org/features/2018/03/live-cell-imaging-deeper-faster-wider。